 |
|
実験医学別冊 無敵のバイオテクニカルシリーズ 特別編
|
| 改訂 バイオ実験の進めかた | ◆ 出版社 ◆ 羊土社 〒101－0052 東京都千代田区神田小川町2-5-1 TEL 03-5282-1211 FAX 03-5282-1212 URL https://www.yodosha.co.jp/ |
||||
|---|---|---|---|---|---|
| ■ 1章 cDNAを手に入れる（クローニング） |
佐々木 博己
A 遺伝子の塩基配列がわかる場合のcDNAの入手法
A-1 ｃDNAライブラリーからｃDNAを手に入れる
1 mRNAを調製する
1-1 細胞質RNAの調製
1-2 総細胞RNAの調製
●グアニジン/セシウムTFA法，塩化リチウム/尿素法
●AGPC (acid guanidium-phenol-chloro-form) 法
1-3 mRNAの分離
●オリゴ(dT)を付加させた担体を用いる
●細胞や組織の溶解，mRNAの分離が一括化されたキットを使う
2 cDNAライブラリーの作製とスクリーニング
2-1 cDNAの合成
●Okayama (岡山)-Berg法
●Gubler-Hoffman法
●リンカー/アダプタープライマー法
2-2 ファージとライゲーション （コンカテマーの形成）
2-3 in vitro パッケージング
2-4 ライブラリーの購入
●既製cDNAライブラリーの購入
●cDNAライブラリーの作製依頼
2-5 ファージのプレーティング
2-6 DNAの塩基配列の相同性を利用して選別する（スクリーニング）
2-7 完全長cDNAをもつクローンを選択する
●遺伝子の塩基配列がわかっている場合
●部分的な塩基配列しか情報がない場合や新しい遺伝子の場合A-2 PCRによってcDNAを手に入れる
●RT-PCR (reverse transcriptase-PCR) 法
●degenerate プライマーを用いたPCR (degenerate-PCR) 法A-3 平均化cDNAライブラリー作製
●PCRで増幅したcDNAから作る方法
●mRNAから作る方法
●一本鎖プラスミドcDNAライブラリーから作る方法A-4 人から手に入れる
B 遺伝子の塩基配列がわからない場合のcDNAの入手法
B-1 精製タンパク質のアミノ酸配列から合成したオリゴヌクレオチドによるcDNAライブラリーのスクリーニング
B-2 mRNAの発現量の差をもとにcDNAを手に入れる
1 cDNAディファレンシャルハイブリダイゼーション (differential hybridization)
2 cDNAサブトラクション (subtraction)
●一本鎖cDNAのハイドロキシアパタイトカラムによる精製
●chemical cross linking subtraction (CCLS)
●cDNA-representational difference analysis (cDNA-RDA)
●enzymatic degrading subtraction (EDS)
●ビオチン化ドライバーcDNAによるテスターcDNAの吸収法
3 mRNAフィンガープリント (finger printing)
●differential display (DD) 法
●RNA fingerprinting by arbitarily primed PCR (RAP-PCR) 法
●fluorescent diｆｆerential display (FDD) 法B-3 cDNAの発現クローニング
1 抗体をプローブとするcDNAクローニング
●ウエスタン法の応用
2 細胞にmRNAやcDNAを導入して目的のcDNAのみを分離する
●Xenopus oocyte （アフリカツメガエル卵母細胞）を用いた発現クローニング
●COS細胞を用いた発現クローニング
●酵母を宿主とした動物細胞cDNAの相補クローニング
3 タンパク質-タンパク質相互作用を利用してcDNAを手に入れる
●ウエストウエスタン法またはファーウエスタン法
●酵母 two-hybrid system4 DNA-タンパク質相互作用を利用してcDNAを手に入れる
●サウスウエスタン法
●COS細胞を用いた発現クローニング
| ■ 2章 タンパク質の精製，抗体の取得とアミノ酸配列決定 |
吉田 真太郎
A タンパク質の精製と抗体の取得
A-1 細胞からタンパク質を手に入れる
1 タンパク質を分画する
●分泌タンパク質の分画法
●細胞質タンパク質の分画法
●核内タンパク質の分画法
●膜タンパク質の分画法
●ミトコンドリアの分画法
●ミクロソームタンパク質の分画法
2 タンパク質を分離する
2-1 沈降法
●硫安沈殿
●有機溶媒によるタンパク質の沈殿
2-2 電気泳動法
●ポリアクリルアミド (PAGE) 電気泳動
●等電点電気泳動
●二次元電気泳動
2-3 カラムクロマトグラフィー
●ゲル濾過クロマトグラフィー
●イオン交換クロマトグラフィー
●疎水クロマトグラフィー
●逆相クロマトグラフィー
●アフィニティークロマトグラフィー
2-4 その他
●透析
●限外濾過A-2 抗体を取得する
1 抗体を作製する
1-1 ポリクローナル抗体
1-2 モノクローナル抗体
B アミノ酸配列を決定する
B-1 アミノ酸配列分析用タンパク質の調製
1 ジスフィルド (S-S) 結合の切断と修飾
2 タンパク質の断片化
●酵素的な断片化
●化学的な断片化
B-2 アミノ酸配列 (一次構造) 決定
●Edman分解法
●マススペクトロメーター
| ■ 3章 遺伝子の構造解析 |
佐々木 博己
A cDNAの塩基配列を決定する（シークエンス）
A-1 アイソトープによる標識法
●マクサム-ギルバート (MG) 法
●サンガー (ダイデオキシ) 法A-2 蛍光シークエンサー（非アイソトープによる標識）
1 スラブゲル電気泳動方式
2 キャピラリー電気泳動方式
B データベースを用いた遺伝子の構造解析と機能予測
B-1 ホモロジー検索による機能予測
1 検索プログラムとデータベース
1-1 プログラム
●ＢＬＡＳＴ
●FASTA
1-2 データベース
●核酸のデータベース
●タンパク質のデータベース
B-2 立体構造の予測
| ■ 4章 遺伝子産物の生化学的解析 |
吉田 真太郎
A タンパク質の活性測定
A-1 タンパク質の生産
●大腸菌に生産させる
●真核生物に生産させる（Baculo Virus合成系など）A-2 生化学的活性を知る
1 キナーゼ活性測定
●キナーゼ活性をもつ酵素タンパク質
●自己をリン酸化する酵素タンパク質
2 その他の活性測定
●脱リン酸化酵素
●補酵素を必要とする酵素タンパク質
●ほかのタンパク質と複合体をなすタンパク質
B タンパク質の局在性の検定を行う
B-1 免疫染色法（免疫組織化学染色法）
1 免疫染色法の種類
●直接法
●PAP法
●ABC法
2 標識物質
●Horse Raddish Peroxidase (HRP)
●Alkaline Phosphatase (ALP)
●蛍光物質
●重金属（金粒子など）で標識した二次抗体
B-2 免疫電顕法
●酵素標識
●重金属標識
●ABC法
●プロテインA
B-3 GFPを利用した局在性検定
C タンパク質-タンパク質の相互作用を調べる
C-1 融合タンパク質を用いて目的のタンパク質の検出を行う
1 融合タンパク質の作製
1-1 大腸菌を利用する
●GST融合タンパク質
●His-tag融合タンパク質
1-2 真核細胞を利用する
●Saccharomyces合成系
●Baculo virus合成系
2 融合タンパク質の精製
●Gultathion （グルタチオン）アフィニティークロマトグラフィー
●金属キレートアフィニティークロマトグラフィーC-2 抗体を用いて目的のタンパク質の検出を行う
1 大量合成タンパク質による抗原の作製
●合成ペプチド
●Saccharomyces合成系
●Baculo virus合成系
2 免疫沈降法
●ウエスタンブロッティングC-3 表面プラズモン共鳴法
Ｄ DNA-タンパク質の相互作用を調べる
D-1 DNA結合因子の解析法
●DNaseⅠフットプリント法
●ゲルシフト法 EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay)
●サウスウエスタン法
●表面プラズモン共鳴法D-2 DNA非結合因子の解析法
●UVクロスリンク法
●ファーウエスタン法
●two-hybrid法
E タンパク質の修飾を解析する
E-1 リン酸化の解析
1 リン酸化タンパク質の検出
2 リン酸化アミノ酸の分析E-2 タンパク質に付加した複合糖鎖の解析
1 糖タンパク質の分離・精製
2 糖鎖の切断
●化学的方法
●酵素的処理
3 糖鎖の同定
| ■ 5章 遺伝子の発現解析 |
落谷 孝広
A 目的のmRNAの発現している組織，細胞，量それに時期，期間を知る
A-1 cDNAセットの購入
A-2 mRNAフィルター，ポリA mRNAアレイの購入
A-3 mRNAの抽出方法
●一般のノーザンハイブリダイゼーション法やドットブロット法でmRNA定量を行う場合
●発現量が少ない，クロスハイブリダイゼーションが問題になる場合，またcDNAライブラリー作製の際
●発現量の見当がつかない場合A-4 発現情報解析の方法
1 核酸レベルでの解析
1-1 ノーザンハイブリダイゼーション法
1-1' ノーザンハイブリダイゼーション法の変法
●エチジウムプロマイド法
●ハイブリダイゼーション法
1-2 RNAドットブロット法
1-3 RNaseプロテクションアッセイ法（リボプローブ・マッピング）
1-4 RT-PCR法
1-5 DNAチップ/マイクロアレイ法2 細胞・組織レベルでの解析
2-1 in situ ハイブリダイゼーション法（ISH法）
2-1-a) 組織切片の作製
●新鮮凍結切片
●パラフィン包埋標本
●灌流固定標本
2-1-b) プローブの選択
●オリゴプローブ
●RNAプローブ
2-1-c) プローブの標識法の選択
1) アイソトープ標識
2) 非アイソトープ標識
●アルカリホスファターゼ (AP) 標識
●ジゴキシゲニン (DIG) 標識
●フォトビオチン標識
●フルオレセイン標識
2-2 in situ RT-PCR法
2-3 核run-onアッセイ法
2-4 マイクロダイセクション法
2-5 組織アレイによる遺伝子発現解析法
B 目的のmRNAの発現調節機構を調べる
B-1 発現はどのレベルで調節されているのかを知る
1 転写レベルでの調節
1-1 転写調節領域を含む遺伝子断片のクローニング
1-1-a) 目的とする遺伝子のcDNAがすでにクローニングされている場合
1-1-b) アミノ酸配列のN末端が同定されている場合
1-1-c) クローニングの方法の概要
1) ゲノムDNAライブラリーの準備
●市販のゲノムDNAライブラリーを購入する
●ゲノムDNAライブラリーをもらい受ける
●ゲノムDNAライブラリーを作製する
2) ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング
2 転写後の各段階で調節されている場合
B-2 発現調節領域の同定
1 プロモーター解析
1-1 レポーター遺伝子発現アッセイ
●CAT (クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ)
●ルシフェラーゼ
●β-ガラクトシダーゼ
●GFP (緑色蛍光タンパク質)
●β-グルクロニダーゼ (GUS)
1-2 欠失変異体による発現調節領域の解析
1-3 DNaseⅠ感受性テスト
1-4 S1マッピング
1-5 リボプローブマッピング (RNaseプロテクション・アッセイ)
1-6 プライマー伸長法
2 エンハンサーの同定
3 in vitro 転写系
3-1 in vitro転写活性を有する細胞抽出液の調製
●全細胞抽出液
●核抽出液
3-2 in vitro転写反応
●run-off転写法
●G-freeカセット法
B-3 転写後の調節機構を知る
B-4 エピジェネティクスによる遺伝子発現調節
C 転写制御因子を解析する
C-1 転写因子の解析
●ゲルシフト法
●DNaseⅠフットプリント法
●メチル化フットプリント法
●UVクロスリンク法C-2 転写因子の精製
●DNAアフィニティークロマトグラフィー法
●DNAアフィニティーラテックス粒子法 (バッチ法による)
●ビオチン-ストレプトアビジンを用いる精製システム
●その他C-3 目的遺伝子と転写因子の相互作用
1 チロシンリン酸化抗体による解析方法
2 In-gelタンパク質リン酸化アッセイ法
3 レポーターアッセイシステム (キット)
|
■ 6章 細胞・生体レベルの遺伝子機能解析 |
落谷 孝広
A 培養細胞への遺伝子導入と発現
A-1 人工変異の導入方法
1 合成オリゴヌクレオチドによる位置指定変異導入法
●PCR法
●ギャップDNA法，ウラシルDNA法2 領域指定変異導入法
●古典的なエキソヌクレアーゼによる欠失法
●亜硝酸による領域指定変異法A-2 発現ベクターのデザイン
1 プロモーター・エンハンサーの選択
1-1 幅広い細胞種を標的にする場合のプロモーター・エンハンサー
●サイトメガロウイルス (CMV) のプロモーター
●チミジンキナーゼ (TK) プロモーター
●ニワトリβ-アクチンのプロモーター
●SV40初期遺伝子プロモーター
●CAGプロモーター
1-2 細胞・組織特異的プロモーター・エンハンサー2 発現調節用ベクターの選択
●大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンを利用した系
●Cre-loxPシステム
●FLP/FRTシステム
●遺伝子発現ベクターシステムの進化A-3 培養細胞への遺伝子導入の方法論
1 生物学的方法
1-1 ウイルスベクター
1-2 特異的受容体を利用する方法
1-3 細胞融合法
●HVJ (センダイウイルス)
●ポリエチレングリコール (PEG)
●電気的細胞融合法2 物理的方法
●マイクロインジェクション法
●エレクトロポレーション法
●ジーンパーティクル (gene gun)3 化学的方法
●リン酸カルシウム沈殿法
●リポソーム法
●DEAEデキストラン法
●ブロトブラスト法
●赤血球ゴースト法，赤血球膜ゴースト法
●マイクロカプセル法A-4 遺伝子組み込み細胞株の樹立
1 選択マーカー遺伝子の選択
●neo (neomycin) 耐性遺伝子マーカー (APH：aminoglycoside phosphotransferase)
●pSV2neoやpRSVneo遺伝子
●hygromycin耐性遺伝子 (ハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子)
2 薬剤耐性細胞株の樹立
3 遺伝子発現細胞株のスクリーニング
●DNAの調製
●RNAの調製
●タンパク質の調製
●セルソーターによる選別法
●細胞染色法
●ELISA
●フォーカスフォーミングアッセイ
●細胞の浸潤能や運動能の測定
●マウスなどの動物への細胞の移植A-5 レポーター遺伝子導入と発現アッセイ法
B アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入による遺伝子の機能解析
B-1 アンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインと全体のプロトコール
1 ターゲット部位デザイン
2 プロトコール
2-1 オリゴヌクレオチドの精製
2-2 オリゴヌクレオチドの修飾
●S-化修飾 (phosphorothioate)
●メチル化修飾 (methylphosphonate)
●アクリジン修飾 (acridine-linked)
●アセチレン炭化水素修飾 (C-5 propyne)
2-3 実験系の確立
B-2 培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入
●カチオン性脂質による遺伝子導入方法の応用
●アンチセンス配列を発現ベクターに組み込む
●Antennapediaペプチド法
C 動物個体への遺伝子導入
C-1 トランスジェニック
1 トランスジェニック動物作製法
●マイクロインジェクション法
●レトロウイルス感染法
●アデノウイルス感染法
●胚性幹細胞 (ES細胞) を用いる方法
2 各種トランスジェニック動物
2-1 トランスジェニックマウス
2-2 トランスジェニックラット
2-3 その他C-2 ノックアウト
1 ノックアウトマウス作製
1-1 ES細胞によるノックアウトマウス作製
1-1-a) ターゲティングベクターの構築
1-1-b) ES細胞への導入
1-2 saturation mutagenesisによる変異マウス作製
2 その他のノックアウト動物
3 その他の個体レベルでの遺伝子機能の抑制方法 (RNAi法)
C-3 生体への全身あるいは局所的遺伝子導入法
●直接遺伝子導入法
●カチオン性リポソームによる方法
●HVJ-リポソーム法
●ウイルスベクター
●in vivo エレクトロポレーション法
●バイオマテリアルによる遺伝子導入法
D 動物個体の大量変異株のバンク状況と取得のための利用法
●米国のジャクソン研究所のホームページ (JAX Mice)
●Lexicon genetics社のホームページ
| ■ 7章 幹細胞 (ES細胞) を用いた実験法 |
落谷 孝広
A ES細胞の樹立と培養，保存などの基礎技術
A-1 ES細胞の取り扱い
1 ES細胞の入手2 ES細胞の培養
3 ES細胞の保存
A-2 フィーダー細胞の注意
●EMFI
●STOA-3 ES細胞への遺伝子導入
1 ES細胞に導入可能な遺伝子ベクター2 遺伝子導入の方法
B ES細胞の分化誘導系を用いた遺伝子機能解析の戦略
B-1 ES細胞のin vitro分化誘導
1 培養シャーレ上での分化誘導
●LIF (－) フィーダー細胞 (－) による分化誘導
●特殊物質 (マトリックス) による分化誘導
●特殊フィーダー細胞による分化誘導2 胚様体 (Embryoid body) を介したin vitro分化誘導
B-2 ES細胞のin vivo分化誘導
| ■ 8章 ゲノム研究時代の網羅的遺伝子研究 |
佐々木 博己
A 癌を含む疾患原因遺伝子の分離・同定
A-1 ポジショナルクローニングによる遺伝性疾患の原因遺伝子の同定
1 連鎖解析による染色体上の位置の予測
1-1 多型性の検定法
●RFLP (restriction fragment lengh polymorphism) を利用
●VNTR (variable number of tandemrepeats) を利用
●CAリピートを利用
2 SNPsを利用した疾患関連遺伝子の同定
A-2 ポジショナルクローニングによる非遺伝性の癌の原因遺伝子の同定
1 染色体の構造異常 (LOH，ホモ欠失，増幅，転座) の同定
1-1 LOH (loss of heterozygosity) の解析
●多型性を利用したLOHの検定法
1-2 In-gel renaturation法
1-3 ゲノムフィンガープリント法
●RLGS (restriction landmark genomic scanning) 法
●AP-PCR (arbitarily primed-PCR) 法
1-4 ゲノムサブトラクション法
●IGCR (in-gel competitive DNA reassociation) 法
●RDA (representative difference analysis) 法
●SIA (selective isolation of amplified DNA sequence) 法
1-5 染色体の転座・逆位部位の同定
●染色体の観察 (カリオタイピング)
●two color FISH法
●multiple color FISH法
●prophase (細胞分裂前期) 染色体でのFISH法
●DNAファイバーFISH法
1-6 CGH法 (comparative genomic hybridization)
1-7 CGHマイクロアレイ法2 メチル化異常の同定
A-3 候補遺伝子の同定
●zoo blot, CpGアイランド (island) を利用した方法
●BAC，P1クローンを直接にプローブとする方法
●exon amplification / exon trapping法
●cDNA selection法
●SPM (segregation of partly melted molecules) 法
●ゲノムDNAクローンのシークエンスA-4 遺伝子変異の同定
1 大きな変化を検索する方法
●Southern hybridization (サザンハイブリダイゼーション) 法
●Northern hybridization (ノーザンハイブリダイゼーション) 法
2 点突然変異を含む微細な変化を検索する方法
●RPA (RNase protection assay) 法
●変性剤濃度勾配ゲル電気泳動 / DGGE (denaturing gradient gel electorophoresis) 法
●SSCP (single strand comformation polymorphism) 法
●WAVE(R)核酸フラグメント解析システムを用いた全自動フラグメント解析
3 その他の方法
●Mutant-allelie-specific amplification (MASA)
●Allele-specific-oligonucleotide (ASO) hybridization
●オリゴヌクレオチドアレイ法
B SNPsによるcommon diseaseのリスク評価
B-1 SNPsデータベース
●dbSNP
●HGBASE (Human Genic Bi-Allelic Sequences)
●ALFRED
●TSC (The SNP Consortium)
B-2 SNPsを利用した疾患関連遺伝子の同定法
●アソシエーション法 (Association study)
●罹患同胞対法 (Sib-pair analysis)
●伝達不平衡解析法 (Transmission disequilibrium test)
C 包括的ゲノム機能解析
C-1 トランスクリプトーム関連技術
1 SAGE (serial analysis of gene expression)
2 iAFLP (amplified fragment length polymorphism)
3 網羅的な遺伝子発現解析のためのマイクロアレイ
4 マイクロアレイの画期的応用例 (細胞への直接遺伝子導入)
●マイクロアレイから動物細胞への直接遺伝子導入法C-2 プロテオーム関連技術
1 生化学的解析
1-1 タンパク質-タンパク質相互作用
●エピトープ・タグを付加したタンパク質によるアフィニティー精製法
●共鳴プラズモン相互作用解析 (BIA-MS法，Biomolecular Intaraction Analysis-MS)
●その他のプロテオーム関連技術
2 物理化学的解析
D バイオインフォマティクス
D-1 ゲノムデータベースの変化
D-2 ゲノム関連データベースの紹介
●統合的ゲノムデータベース
●遺伝子検索データベース
●遺伝子発現データベース
●遺伝子間ネットワークデータベース
●疾患関連データベース
| ■ 付録 |
バイオ研究に役立つサイト紹介
| ■ 索引 |
![[バイオウェブ - HOME]](../../../images/home01.gif)
BIOWEB(R)サービスに関するお問い合わせ：
service@bioweb.ne.jp