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実験医学別冊 Experimental Medicine |
| 細胞・組織染色の達人 実験を正しく組む、行う、解釈する免疫染色とISHの鉄板テクニック |
◆ 出版社 ◆ 羊土社 〒101-0052 東京都千代田区神田小川町2-5-1 TEL 03-5282-1211 FAX 03-5282-1212 URL https://www.yodosha.co.jp/ |
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高橋英機／監，大久保和央／著，ジェノスタッフ株式会社／他
序文
序章 染色をはじめる前に考えること
1.免疫染色とin situ Hybridization
2.蛍光か発色か？
3.染色をはじめるにあたって，最初に考えること
第1章 動物の解剖と固定
[1] 動物実験をはじめる前に
1.適切な動物実験を行うための一般原則
2.適正な動物飼育を行うための動物福祉
3.マウス・ラットの試料採取に必要な麻酔薬と安楽死処置
4.最後に[2]切片・固定液の種類と器具の準備
1.切片の種類
2.動物の解剖〜切片作製までの流れ
3.固定液の種類と組成
4.解剖，灌流固定に用いる実験器具[3]解剖，灌流固定法の実際
1.灌流固定か，浸漬固定か？
2.灌流固定の方法
第2章 組織のサンプリング
[1]灌流固定を必要とする組織
1.脳
2.下垂体
3.脊髄
4.後根神経節
5.肝臓
6.腎臓，副腎
7.膵臓
8.脾臓
9.気管＋甲状腺
10.胸腺
11.唾液腺
12.舌
13.白色脂肪，褐色脂肪
14.子宮，卵巣
15.乳腺[2]灌流固定を必要としない組織
1.胃，十二指腸
2.小腸，大腸
3.皮膚
4.眼
5.骨組織(1)：大腿骨
6.骨組織(2)：膝関節
7.骨組織(3)：内耳（蝸牛）
8.骨組織(4)：歯（下顎）
9.血管
10.胎仔，新生仔，胎盤
11.筋肉
12.精巣，精巣上体
13.ゼノグラフト[3]どちらでもよい組織
1.心臓
2.骨髄
3.膀胱
4.肺[4]培養細胞のサンプリング
1.調製方法の種類と選び方
2.プロトコール
3.染色例
第3章 ブロック作製
[1]組織の前ｚ処理
1 パラフィン包埋のための固定後の処理
2 脱脂
3 脱灰[2] パラフィンブロックの作製（包埋）
1 パラフィン包埋
2 ブロックの成形
3 パラフィンブロックの保存[3] 凍結ブロックの作製
1 未固定凍結ブロックの作製
2 既固定凍結ブロックの作製
3 凍結ブロックの保存
第4章 薄切
[1] パラフィン切片の作製と保存
1 切片の厚み
2 パラフィン切片作製の手順
3 パラフィン切片の保存[2] 凍結切片の作製と保存
1 凍結切片作製時の温度・厚さ
2 凍結切片作製の手順
第5章 免疫組織化学染色
[1] 抗体を選ぶ
1 抗体の候補を選ぶ
2 候補の絞込[2] 染色の流れ
1 条件検討に用いる切片の準備
2 脱パラフィン〜前処理（抗原賦活化，各種ブロッキングなど）
3 一次抗体反応
4 検出系[3] 免疫染色の準備
1 器具
2 試薬（LSAB法）
3 ABC法，ポリマー法，mouse on mouseで使用する試薬[4] 免疫染色プロトコール（LSAB法）
1 作業前の準備
2 プロトコール
3 簡易プロトコール[5] 染色結果を評価する
1 免疫染色の条件検討
2 免疫染色の答え合わせ（免疫染色）
第6章 in situ ハイブリダイゼーション（ISH）
[1] ISHの原理
1 プローブの種類
2 ISHの手順
3 染色のコントロールのとり方[2] プローブの設計
1 設計の注意点
2 設計方法[3] プローブを作製する
1 設計した遺伝子配列の増幅
2 プローブ領域のクローニング
3 in vitro transcription反応によるDIG標識RNA合成
4 ドットブロット法によるプローブの濃度測定[4] ISH染色
1 準備
2 染色条件の設定
3 プロトコール
4 染色例
第7章 多重染色，その他の染色
[1] ISH（発色）＋免疫染色（発色）
1 二重染色の条件検討
2 二重染色の手順[2] 免疫染色＋免疫染色
1 免疫染色（発色）＋免疫染色（発色）
2 免疫染色（蛍光）＋免疫染色（蛍光）[3] HE染色
1 試薬
2 プロトコール[4] TUNEL染色
1 TUNEL染色の原理
2 プロトコール
コラム（達人への一歩）
(1) サンプルや染色方法によって固定液を選ぶ
(2) 大切なシグナルを失わないための灌流固定
(3) 灌流固定による組織の形態の変化
(4) PCR法を用いたマウス胎仔の性判別法
(5) 溶剤の使い回しはほどほどに
(6) RNaseにはどこまで気をつければ良いのか？
(7) 湿度が染色の成否を左右する？！
(8) 使える抗体はGoogle先生に聞こう
(9) 臨床検体でのISH
(10) ISHのネガコンはセンス鎖のみでよいのか？
(11) プラスミドからのRNA合成用鋳型調製
(12) プローブのアルカリ処理に要注意
(13) 最適なProK濃度の探し方
(14) ハイブリチャンバーの気密性と湿度調節
(15) 長すぎるハイブリ時間にご用心
(16) ISH発色停止のタイミング
(17) カウンターステインの種類とコツ
(18) ISHの検出感度と遺伝子の発現分布
(19) 二重染色ができない組み合わせの抗体について
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