ラボ必携フローサイトメトリーQ&A

実験医学別冊　Experimental Medicine

ラボ必携フローサイトメトリーQ&A 正しいデータを出すための100箇条				◆　出版社　◆　羊土社〒101-0052 東京都千代田区神田小川町2-5-1 TEL 03-5282-1211 FAX 03-5282-1212 URL https://www.yodosha.co.jp/

戸村道夫／編

概論　これからフローサイトメトリーをはじめる方のための，基本と解析の全体像
【戸村道夫】

第1章フローサイトメトリー解析をする前に知っておきたいこと

Q1 フローサイトメトリー解析とは，何を見るための実験手法でしょうか？何ができるのでしょうか？
【二村孝治】
Q2 フローサイトメトリーではどのような原理で細胞を解析するのでしょうか？
【金山直樹】
Q3 フローサイトメトリー解析の実際の流れを教えてください．特別な実験手技や，コンピューターの知識は必要でしょうか？
【金山直樹】
Q4 細胞をソーティングするにはどうすればよいですか？セルソーターのセッティングから具体的な流れを教えてください．
【金山直樹】
Q5 「蛍光発光の原理」と「励起波長」，「蛍光波長」について，知っておくべきことを教えてください．
【齋藤　滋】
Q6 「レーザー光源」と「光学フィルター」について教えてください．「530/30」と記載されたフィルターは，どのような波長を検出するのでしょうか？レーザーの「同軸」「異軸」の違いは何でしょうか？
【長坂安彦】
Q7 コンペンセーション(蛍光補正)とは何でしょうか？
【方波見幸治】
Q8 フローサイトメトリー解析で得られるデータと蛍光顕微鏡・共焦点顕微鏡で得られるデータの違いは何でしょうか？
【方波見幸治】
Q9 フローサイトメトリー初心者が失敗しがちなポイントを教えてください．
【石井有実子】

第2章フローサイトメーターの購入・取り扱い，その他装置の基本に関するQ&A

Q10 フローサイトメーターの購入を検討しています．“アナライザー"か“セルソーター"か，“エントリーモデル"か“ハイエンドモデル"か，どのように考えればよいでしょうか？
【石井有実子】
Q11 フローサイトメーターへの細胞の取り込み方法にはどのようなものがありますか？オートサンプラーとは何ですか？気をつけるべき点と合わせて教えてください．
【上羽悟史】
Q12 新しく発売されたフローサイトメーター(アナライザー)を購入するときに注意することは何ですか？レーザーは何本，何色検出できる必要がありますか？購入後にアップグレードすることはできますか？
【石井有実子】
Q13 各社からいろいろなセルソーターが発売されていますが，どのような違い・特徴がありますか？
【石井有実子】
Q14 快適にフローサイトメーターを使い続けるために必要なことは何ですか？メンテナンス機器保守契約には入った方がよいですか？
【清永信之】
Q15 フローサイトメーター・セルソーターはどのような部屋に設置すればよいのでしょうか？…
【清永信之】
Q16 フローサイトメーター・セルソーターの起動時，シャットダウン時に気をつけることはありますか？
【二俣吉樹】
Q17 一般的な光電子増倍管(PMT)による検出以外にはどのような方法がありますか？
【戸村道夫，二村孝治】

第3章抗体，色素の特性・選び方に関するQ&A

Q18 まず，4カラーを使いこなすには，どうすればよいでしょうか？分離のよい明るい蛍光色素の選択や，複数の蛍光色素を組合わせる際の注意点を教えてください．
【田中　聡】
Q19 細胞の蛍光標識方法には，どのような種類があるのでしょうか？
【梅本英司】
Q20 ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらを使うべきでしょうか？それぞれの長短所や注意点があれば教えてください．
【守屋大樹】
Q21 カタログにある抗体の「CD分類」と，各種免疫細胞の識別に用いる抗体の組合わせを教えてください．
【奥山洋美，戸村道夫】
Q22 フローサイトメトリーに用いる蛍光色素と，蛍光顕微鏡観察に用いる蛍光色素に使い分けはありますか？
【梅本英司】
Q23 ダイレクト色素(単一)とタンデム色素は何が違うのでしょうか？長短所や注意点を教えてください．
【倉知　慎】
Q24 市販抗体を購入する際に，気をつけるべきポイントを教えてください．
【倉知　慎】
Q25 抗体の保存方法や使用期限について教えてください．
【佐藤幸夫】
Q26 抗体の至適濃度(希釈倍率)の決め方，染色の条件(細胞数，懸濁液量，温度)を教えてください．
【守屋大樹】
Q27 抗体反応のネガコンとして「アイソタイプコントロール」を用いると聞きましたが，それはなぜですか？また，どのように選べばよいですか？
【楠本　豊】
Q28 できるだけ強くシグナルを検出するには，どのような方法がありますか？
【阿部　淳】
Q29 非標識抗体しか入手できません．目的分子を検出するにはどのような方法がありますか？
【池渕良洋】
Q30 生きたまま細胞核，細胞質，細胞膜などを染色するのに適した色素にはどのようなものがありますか？細胞周期の解析もできますか？
【永澤和道，渡会浩志】
Q31 死細胞を検出・除去するにはどうすればよいですか？アポトーシスとネクローシスは分離できますか？
【池渕良洋】
Q32 細胞固定をしても死細胞と生細胞を区別できる色素があると聞きました原理と使い方を教えてください．
【池渕良洋】
Q33 市販されている蛍光色素標識抗体の全体像と特徴を教えてください．
【戸村道夫】
Q34 マルチカラー解析で蛍光色素を追加していくときの順番を教えてください．
【戸村道夫】
Q35 マルチカラー解析のパネルを組む際のコツを教えてください．
【戸村道夫】

第4章サンプル調製(細胞調製と色素標識・抗体染色)に関するQ&A

Q36 血液，培養細胞，組織からの細胞調製では，それぞれ何に気をつけるべきですか？
【石井有実子】
Q37 腫瘍からの細胞調製と代表的な染色パネルについて注意すべきことを教えてください．
【上羽悟史】
Q38 皮膚からの細胞分離方法と代表的な染色パネルを教えてください．
【小野さち子，本田哲也】
Q39 腸管からの細胞分離と，代表的な染色パネルを教えてください．
【梅本英司】
Q40 肺，肝臓からのリンパ球分離方法を教えてください．
【高村史記】
Q41 リンパ球組成はマウスの系統間で異なりますか？また，マウスとヒトのリンパ球解析で異なることと気をつけることを教えてください．
【大津　真】
Q42 ヒトの末梢血の解析をはじめて行います．解析の概略と代表的な染色パネルを教えてください．
【大津　真】
Q43 骨髄血を用いた白血病の診断と治療効果の解析に用いる，代表的な染色パネルを教えてください．
【東　克巳，方波見幸治】
Q44 サンプルが得られたときに染色する時間，あるいは，染色後にフローサイトメーターに流す時間がありません．後日，実験する手段はありますか？
【池渕良洋】
Q45 細胞の抗体染色に適したバッファー(FACS バッファー)の組成を教えてください．
【長坂安彦】
Q46 抗体の非特異的反応性を抑えるには，どうすればよいでしょうか？
【増田喬子】
Q47 T細胞受容体をMHC+ペプチド-マルチマーで検出したいと考えています．特徴や染色の工夫を教えてください．
【高村史記】
Q48 サイトカイン産生細胞におけるサイトカイン検出の原理を教えてください．また，生きたままサイトカイン産生細胞を分離することはできますか？
【藤本華恵】
Q49 細胞表面分子とともに，細胞内サイトカインや細胞核のタンパク質を染色したいです．染色の順番や注意する点を教えてください．
【藤本華恵】
Q50 細胞内シグナリング(リン酸化タンパク質)の検出はどうすればできますか？
【宮内浩典，久保允人】
Q51 CFSEなどの細胞標識蛍光色素を用いて細胞増殖活性を測定したいと考えています．染色法および解析のコツを教えてください．
【倉知　慎】
Q52 細胞増殖している細胞としていない細胞は，区別することはできますか？…
【永澤和道，渡会浩志】
Q53 フローサイトメトリーでは，どのようにコントロール(ネガティブならびにポジティブ)をとればよいでしょうか？
【四ノ宮隆師】
Q54 細胞の絶対数を測定できますか？内部スタンダードのビーズが必要になるのはどのようなときですか？
【上羽悟史】

第5章測定・リアルタイム解析に関するQ&A

Q55 4カラーのフローサイトメーターを用いてはじめて測定します．何に気をつけるべきですか？
【田中　聡】
Q56 ネガティブシグナルの検出器電圧設定で注意する点はどこですか？一番感度がよいところに設定するにはどうしたらよいですか？
【田中　聡】
Q57 測定時には，最低限どのようなゲーティングがあるとよいでしょうか？
【阿部　淳】
Q58 細胞は何個/秒の速度まで流せますか？最適な細胞濃度はどのくらいですか？
【石井有実子】
Q59 磁気細胞分離法やpre-depletionとは何ですか？どのようなときに必要ですか？
【高村史記】
Q60 解析したい細胞の頻度がとても低く，ゲーティングした一部の細胞のデータだけを取得したいです．どうすればよいでしょうか？
【小西祥代】
Q61 少ない細胞のサンプルからできるだけ多くのデータをとりたいのですが，よい方法はありますか？
【齋藤　滋】
Q62 蛍光標識抗体で染色したはずが，シグナルが検出されない場合や，条件設定のときに比べて弱いシグナルしか検出できない場合，どのような原因が考えられますか？
【阿部　淳】
Q63 サンプルの流れが悪く，イベントレートが安定しないときがあります．流れを安定させる方法はありますか？
【小西祥代】
Q64 途中で凝集塊やエアを吸ってしまいました．次のサンプルの測定前にするべきことは何でしょうか？データは使用できますか？
【角　英樹】

第6章セルソーティングに関するQ&A

Q65 細胞をはじめてソーティングするときに，気をつけるべきポイントはありますか？
【藤本華恵】
Q66 ドロップディレイ(Drop Delay)とは何ですか？どのように設定すればよいでしょうか？
【増田喬子】
Q67 各メーカーでいろいろなソーティングモードがあります．どれを選べばよいでしょうか？…
【石井有実子】
Q68 リンパ球に比べてサイズがとても大きな細胞をソーティングする予定です．ノズル径，シース圧はどのような設定が適していますか？
【増田喬子】
Q69 ソーティング中，頻繁に詰まってしまい，ストリーム，ドロップがなかなか安定しません．解決方法はありますか？
【藤本華恵】
Q70 ソーティングした細胞を回収するときによい方法やコツはありますか？
【藤本華恵】
Q71 ソーティングしたい細胞の割合が非常に低く，ソートに長時間かかってしまいます．よい解決法はありませんか？
【藤本華恵】
Q72 直接プレートにソーティングする「シングルセルソーティング」はどのようなことができますか？また気をつける点はありますか？
【藤本華恵】
Q73 ソーティング中にエアーを吸ってドロップレット形状が崩れ，ストリームが乱れてしまいました．どうすればよいですか？
【齊藤政宏】
Q74 ソーティングによる細胞へのダメージをなるべく少なくしたいです．どのような設定，工夫をすればよいでしょうか？
【石井有実子】

第7章データ解析・管理，論文執筆に関するQ&A

Q75 FlowJoの基本機能とあまり知られていない便利な使い方を教えてください．
【中根優子】
Q76 細胞のゲーティングの基礎を教えてください．
【田中　聡】
Q77 データの各パラメーターに表示されている「-A」「-H」「-W」は，どのような意味ですか？データ解析ではどのように扱えばよいですか？
【田中　聡】
Q78 ゲーティングの過程で死細胞や凝集細胞をゲートアウトできる原理がわかりません．なぜそのようなことができるのでしょうか？
【田中　聡】
Q79 自家蛍光の高い細胞が目的の細胞に重なってしまい困っています．自家蛍光の高い細胞をゲートアウトすることはできますか？
【結城啓介】
Q80 腫瘍細胞や組織細胞からリンパ球をゲーティングするコツを教えてください．
【嘉陽啓之】
Q81 コンペンセーション(蛍光補正)をどの程度かけるべきかがわかりません．また，注意すべきことは何ですか？
【菅原ゆうこ】
Q82 解析したい細胞の頻度が0．1%以下ととても低く苦労しています．よいデータ解析法，表示法はありますか？
【山口　亮】
Q83 2つのポピュレーションがはっきりと区別できず困っています．どのようにゲーティングすればよいでしょうか？
【田中　聡】
Q84 蛍光色素数が多いデータを解析していますが，検出しているシグナルが目的のシグナルか，他の蛍光色素からの漏れ込みによるものか判別できません．どうすればよいでしょうか？
【田中　聡】
Q85 MFI(平均蛍光強度)はどのようなときに使いますか？
【日野和義，小川恵津子】
Q86 二次元プロットには複数の表示形式がありますが，論文への掲載にはどれが適切ですか？また，Biexponentialとは何ですか？
【田中　聡】
Q87 フローサイトメトリーの細胞ゲーティングや，統計計算したデータは，どのように表記して，論文投稿すればよいですか？
【戸村道夫】
Q88 実験ノートにはどのような情報を記載したらよいですか？またデータの管理はどうすればよいですか？
【安田　剛】

第8章非リンパ球・非モデル生物細胞への適用に関するQ&A

Q89 リンパ組織のストローマ細胞はどのように調製すればよいでしょうか？
【片貝智哉】
Q90 神経細胞の解析と，臨床用のソーティングについて教えてください．
【土井大輔，高橋　淳】
Q91 肝臓幹細胞・前駆細胞のフローサイトメトリー解析と，ソーティングについて教えてください．
【紙谷聡英】
Q92 遺伝子導入したiPS細胞を分離したいと考えています．どういう点に注意すればよいでしょうか？
【南川淳隆，金子　新】
Q93 ウイルスに感染したサルのリンパ球の解析を行いたいのですが，その際の工夫と注意点を教えてください．
【山本浩之】
Q94 マウス，ヒト，サル以外の哺乳動物や鳥類のリンパ球の解析をしたいのですが，どのような解析が可能でしょうか？
【岡川朋弘】
Q95 魚類(サケ・マス類，マグロ類，ゼブラフィッシュやメダカなど)から調製した細胞のフローサイトメトリー解析やソーティングは可能でしょうか？
【林　誠，市田健介，吉崎悟朗】
Q96 非リンパ球，魚類胚由来の細胞など，とてもダメージに弱いデリケートな細胞をダメージレスセルソーターでソーティングしたいと考えています．メリット・デメリット，ソーティングの実際を教えてください．
【斎藤大樹，後藤理恵】
Q97 病原体を含む細菌をフローサイトメトリーによって解析・ソーティングすることは可能でしょうか？また，注意点は何ですか？
【細見晃司，國澤　純】
Q98 土壌細菌や昆虫の腸内細菌の解析とソーティングについて教えてください．
【新谷政己】
Q99 微細藻類の解析とソーティングについて教えてください．
【河地正伸】
Q100 植物分野ではどのような解析が行われていますか？
【板井章浩】